葡萄籽原花青素的提取和檢測(cè)方法
　　1 葡萄籽原花青素的概念、性質(zhì)和安全性

　　1．1 原花青素的概念

　　研究表明，葡萄籽中原花色素物質(zhì)只有原花青素 一種[21。關(guān)于原花青素的定義還不統(tǒng)一。原花青素因在 酸性介質(zhì)中加熱產(chǎn)生紅色的花青素而得名【3】，而兒茶素 類(lèi)單體在熱酸條件下反應(yīng)沒(méi)有花色素現(xiàn)象，所以?xún)翰?素單體應(yīng)不屬于原花青素。這個(gè)概念也得到了美國(guó)葡 萄籽方法評(píng)定委員會(huì)和國(guó)內(nèi)主要生產(chǎn)葡萄籽提取物的企業(yè)認(rèn)可。葡萄籽原花青素是由兒茶素、表兒茶素及其 沒(méi)食子酸酯通過(guò)C4-C 或C4-C。鍵共價(jià)相連組成的多 聚體 ，結(jié)構(gòu)通式見(jiàn)圖l【5J。通常把二～四聚體稱(chēng)為低聚 體(OPCs)，五聚體及五聚體以上的稱(chēng)為高聚體。

　　R=3p—OH兒茶素，R=3p—O一沒(méi)食子酸兒茶素O一沒(méi)食子酸酯 R-3a-OH表兒茶素。R-3a-O一沒(méi)食子酸表兒茶素o-沒(méi)食子酸酯

　　圖1 原花青素的結(jié)構(gòu)及其組成單元

　　1．2 原花青素的主要性質(zhì)

　　原花青素在熱酸條件下能夠生成紅色的花青素，此性質(zhì)可用于原花青素的定性和定量分析。結(jié)構(gòu)中具 有較多的羥基，具有較大的極性，使其能夠很好的溶解 于水、甲醇、丙酮、乙醇等極性溶劑而不溶解于苯、氯 仿、石油醚等非極性物質(zhì)。較多羥基結(jié)構(gòu)也使其成為良 好的氫原子給予體，具有較強(qiáng)的抗氧化性質(zhì)。研究表 明，在0 一、·OH、·CH，中，原花青素對(duì)0：一·清除能力最 好，而且在聚合度2～5之間范圍內(nèi)，隨聚合度增加而增 加柳。對(duì)其構(gòu)效關(guān)系分析表明，帶有沒(méi)食子?；脑ㄇ?素具有更強(qiáng)的抗氧化活性，二聚體的抗氧化活性均比單 體兒茶素的活性強(qiáng)。c 一c 連接的二聚體比c 一c 連 接的二聚體具有更強(qiáng)的抗氧化活性 。原花青素的最大 吸收波長(zhǎng)在280 nm附近，使其具有較強(qiáng)的紫外吸收能 力。以上的主要性質(zhì)使原花青素很好的用于保健食品 和化妝品的開(kāi)發(fā)。

　　13 原花青素產(chǎn)品的安全性

　　美國(guó)Creighton大學(xué)葡萄籽原花青素研究組與美 國(guó)環(huán)境保護(hù)局根據(jù)有毒物質(zhì)控制條例健康效果測(cè)試手 冊(cè)協(xié)同進(jìn)行了葡萄籽原花青素萃取物(GSPE)的一系 列毒性和生物功效研究。結(jié)果證明GSPE具有很高的 安全性和很好的清除自由基、抗氧化能力【8】。日本學(xué)者 Yamakoshi等也采用一系列毒理性試驗(yàn)確證富含原花 青素的葡萄籽提取物具有很高的安全性。完全可以用 于功能性食品的開(kāi)發(fā).

　　2 原花青素的提取方法

　　提取原花青素常用的方法有水提取法、有機(jī)溶劑一 水提取法和儀器輔助提取法。葡萄籽中的原花青素物 質(zhì)通常以結(jié)合態(tài)與蛋白質(zhì)、纖維素結(jié)合在一起fl01，一般 不易提出，通常選用有機(jī)溶劑或水提取，具有斷裂氫鍵 的作用。同時(shí)由于有機(jī)溶劑的滲透性較差，一般不單獨(dú) 使用，常需要水作為傳質(zhì)劑。

　　2．1 水提取法

　　Masquelier~l-嘬早從松樹(shù)皮中用沸水粗提、乙酸乙 酯純化得到原花青素。選水作為提取劑，浸提耗時(shí)長(zhǎng)， 溫度高，容易造成原花青素的損失。同時(shí)水的極性較 大，溶出雜質(zhì)也較多。

　　2．2 有機(jī)溶劑一水提取法

　　甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青 素常用的有機(jī)溶劑，它們對(duì)原花青素有很好的溶解性， 它們的極性大II,Jt~序?yàn)榧状?gt;乙醇>丙酮>乙酸乙酯。 乙醇是常用的提取溶劑，價(jià)格低廉，來(lái)源豐富。乙酸乙 酯提取出的原花青素成分生物活性較好，但是由于極 性較小，對(duì)原花青素的提取并不完全。甲醇和丙酮水溶 液(50％～75％)對(duì)原花青素都有較好的提取性能，同時(shí)也多用做原花青素含量測(cè)定時(shí)的提取溶劑。熊何 -21比 較了甲醇、乙醇、丙酮水溶液對(duì)多酚的提取效果，結(jié)果 表明70％丙酮水溶液為最好溶劑。丙酮水溶液提取效 果好的原因：原花青素分子含有多個(gè)苯環(huán)和醚鍵，油溶 性較強(qiáng)，同時(shí)又有大量的羥基連接在分子骨架上，在水 中具有很好的溶解性，擁有油水雙溶性的丙酮與之相 互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相應(yīng)得 到提高。

　　2-3 儀器輔助提取法

　　超臨界萃取和超聲波輔助提取越來(lái)越多的用于葡 萄籽原花青素的提取。超臨界CO：萃取率高，而且使原 花青素不受到空氣和光的影響，但由于設(shè)備昂貴，推廣 使用比較困難。超聲波法應(yīng)用比較廣泛，超聲波產(chǎn)生的 強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌等特殊 作用，可以破壞植物的細(xì)胞壁，使溶劑滲透到細(xì)胞中， 令其中的化學(xué)成分溶于溶劑中，從而提高提取效率。 在提取原花青素之類(lèi)的熱敏性物質(zhì)顯示出優(yōu)越的性 能.

　　3 葡萄籽原花青素的檢測(cè)

　　由于葡萄籽和葡萄籽提取物中大多數(shù)多酚是原花 青素(一般占70％～85％)，所以很多廠家使用原花青 素來(lái)標(biāo)定其中有效成分的含量。原花青素含量是反映 葡萄籽提取物或葡萄籽質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，主要有兩個(gè) 指標(biāo)，分別為原花青素值和原花青素含量。

　　3．1 原花青素值的測(cè)定

　　原花青素值的測(cè)定采用Bates—smith法和Poaer 法。原理：原花青素在酸性條件下加熱轉(zhuǎn)化為紅色的花 青素，而兒茶素、表兒茶素等黃烷一3一醇單體沒(méi)有此反 應(yīng)(圖2)。它們測(cè)出的結(jié)果是原花青素的相對(duì)含量，分 別用原花青素指數(shù)和PVU表示，是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指數(shù)一般在80～100之 間，PVU一般在250～350之間。

　　原花青素值只是相對(duì)含量，并非原花青素的真實(shí) 含量。據(jù)調(diào)查，同為原花青素值95的產(chǎn)品，多酚含量相 差15％，質(zhì)量大相徑庭四。很多生產(chǎn)廠家使用原花青素 指數(shù)來(lái)表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是錯(cuò)誤的。

　　圖2 花青素生成反應(yīng) Fig．2 Reaction ofproducing cyaniding

　　3．2 原花青素含量的測(cè)定

　　原花青素的含量測(cè)定方法很多，也比較混亂。常用 的有以下幾種方法。

　　3．2．1 鐵鹽催化法

　　此方法的反應(yīng)原理與原花青素值測(cè)定原理相 同，在計(jì)算原花青素的含量時(shí)使用了原花青素標(biāo)準(zhǔn) 品。Fe¨、鹽酸為常用的催化劑和酸解劑。由于水、乙 醇為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)吸光值很低，一般采用正丁醇為反 應(yīng)介質(zhì)【15-161。通常的具體操作：取1．0 mL樣液(或原花 青素溶液)于10 mL刻度試管中，加入6．0 mL正丁醇一 濃鹽酸(95：5)與2％ 硫酸鐵銨溶液(溶解于2 mol／L 鹽酸)0．2mL，混勻，置于沸水浴中加熱40min后，立即 取出用冰水快速冷卻至室溫，在550 Nm處測(cè)定吸光值。

　　此方法較簡(jiǎn)便，而且對(duì)原花青素的選擇性反應(yīng)較 好。鐵鹽催化法對(duì)反應(yīng)體系中的含水量和Fe 濃度要求 比較嚴(yán)格，一般要求含水量6％，F(xiàn)e 濃度4．5x10 ％， 而且過(guò)高的Fe¨濃度對(duì)反應(yīng)沒(méi)有影響【l51。傅武勝【l61 研究表明3％～4％為合適的含水量，F(xiàn)e 濃度選擇在 9．OxlO ％左右。但是也有學(xué)者總結(jié)分析2％～6％含 水量對(duì)花青素的形成有抑制作用，稍高的Fe¨濃度 (>15 g／L)也抑制花青素的生成.

　　在鐵鹽催化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，楊大進(jìn)【l I等人利用高 效液相色譜法檢測(cè)了原花青素含量。該方法將原花青 素在上述鐵鹽催化條件下生成的深紅色花青素離子 進(jìn)行高效液相色譜分析，從而確定原花青素的含量。 此方法能夠排除部分雜質(zhì)的影響，具有定性定量準(zhǔn)確 的優(yōu)點(diǎn)。

　　3．2．2 香草醛法

　　測(cè)定原理：原花青素和兒茶素類(lèi)單體的A環(huán)的化 學(xué)活性較高，在酸性條件下，其上的問(wèn)苯二酚或間苯 三酚與香草醛發(fā)生縮和，產(chǎn)物在濃酸作用下形成紅色 的正碳離子，樣品的濃度與產(chǎn)生的顏色呈正相關(guān)，在500 llm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸收光值【l91(圖3)

　　圖3 酚醛縮合反應(yīng)

　　香草醛法測(cè)定時(shí)，一般以?xún)翰杷貫闃?biāo)準(zhǔn)物，以甲醇為溶劑。鹽酸、硫酸均可作為反應(yīng)過(guò)程的催化劑，但在 使用硫酸時(shí)，濃度不易過(guò)高，過(guò)高的硫酸易使香草 醛發(fā)生自縮合反應(yīng)和氧化分解 。具體的操作方式 較多：1 mL試液+2．5 mL 1％香草醛甲醇溶液+2．5 mL 25％硫酸或8％鹽酸(均溶解于甲醇)，30。【二下反應(yīng) 15 min～20 min【2l。丑 ；1 mL試液+6 mL 4％香草醛甲醇 溶液+3 mL濃鹽酸，室溫下反應(yīng)15 minL231；有的更是在 2O℃下反應(yīng)15 h[241。操作方式差別較大，不利于使用 者的選擇，有待于統(tǒng)一。

　　3．2_3 紫外分光光度法

　　原花青素為無(wú)色物質(zhì)，在可見(jiàn)光區(qū)無(wú)特征吸收峰， 在紫外區(qū)有唯一特征吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)在280 Nm 處。盡管此方法簡(jiǎn)單快捷，但是此方法只適用于原花青 素含量純度特別高的產(chǎn)品，不適合一般原料中原花青 素的檢測(cè)。這是因?yàn)閮翰杷仡?lèi)在280 Nm處也有最大吸 收，V 、Vc、Ve。、Ve 、蘆丁、B一胡蘿卜素等物質(zhì)在此波長(zhǎng) 處都有明顯的吸收.

　　3．2．4 Folin—Ciocaheau與HPLC結(jié)合法

　　此方法為美國(guó)葡萄籽方法評(píng)定委員會(huì)推薦使用的 方法。Folin—Ciocaheau法測(cè)定的是多酚含量，一般以沒(méi) 食子酸為對(duì)照物。在堿性溶液中，多酚可以將鎢鉬酸還 原，生成藍(lán)色的化合物，在760 Nm處有最大吸收。葡萄 籽提取物中的多酚含量一般在75％～95％之間。利用 HPLC測(cè)定沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi) 食子酸酯四種單體的含量來(lái)代表單體的總量。這是因 為它們四種單體的含量占到了葡萄籽提取物中單體含 量的90．0％以上。原花青素的含量則為多酚含量與單 體含量相減之差。

　　此方法缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、抗壞血酸等 易被氧化的物質(zhì)也參與Folin—Ciocalteau反應(yīng)。同時(shí)由 于葡萄籽提取物中沒(méi)食子酸含量甚微(0％～1．2％)，與 兒茶素(1．5％～7．3％)和表兒茶素(2．0％～5．1％)含量 相差懸殊四，原花青素含量用沒(méi)食子酸量來(lái)表示缺乏 代表性。

　　3．2．5 鉬酸銨分光光度法

　　它是基于鄰苯二酚與鉬酸銨在弱酸性介質(zhì)中生成 黃色鉬酸酯，反應(yīng)產(chǎn)物在333 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收。 馬亞軍 寸檢測(cè)條件進(jìn)行了簡(jiǎn)單摸索：取0．08 mol，L鉬 酸銨1 mL溶液置于25mL比色管，加人適量試液，用 1．OxlO mol／L鹽酸沖至刻度，反應(yīng)瞬間完成。

　　根據(jù)反應(yīng)原理，花色素、沒(méi)食子酸、兒茶素類(lèi)都具 有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，也參與鉬酸酯的生成，測(cè)定原花青素 的選擇性不高，受到雜質(zhì)影響較大。

　　3．2．6 其它測(cè)定方法

　　馬亞軍 對(duì)原花青素含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究： 高鐵鹽一鐵氰化鉀分光光度法，它是基于原花青素能將 Fe 還原成Fe ，F(xiàn)e 與鐵氰化鉀生成可溶性深藍(lán)色配 位化合物，在710 nm處有最大吸收的原理；硫酸高鈰 銨分光光度法，它是基于原花青素與Ce“在強(qiáng)酸性介 質(zhì)中反應(yīng)生成無(wú)色的Ce ，Ce“在319 nm波長(zhǎng)處具有 最大吸收，通過(guò)測(cè)定黃色高鈰鹽的吸光度，間接測(cè)定原 花青素。另外還有流動(dòng)注射一抑制化學(xué)發(fā)光法[271：在堿 性條件下，利用原花青素還原H：O：可抑制魯米諾一 H20 體系的化學(xué)發(fā)光，其抑制的程度與原花青素濃度 之間呈線性關(guān)系。這三種方法如同F(xiàn)olin—Ciocaheau法 利用多酚的還原性質(zhì)測(cè)定多酚含量的原理，結(jié)果都擴(kuò) 大了原花青素的含量。

　　綜上所述，原花青素值的測(cè)定只是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式， 并不是原花青素真實(shí)含量，與現(xiàn)代檢測(cè)方法相落伍。鐵 鹽催化法測(cè)定原花青素專(zhuān)屬性較強(qiáng)，有很好的應(yīng)用前 景，但仍需要進(jìn)一步的研究與改進(jìn)。香草醛法測(cè)定的是 原花青素和黃烷一3一醇單體的總量，與HPLC法檢測(cè)黃 烷一3一醇單體：兒茶素、表兒茶素含量相結(jié)合起來(lái)可以 計(jì)算原花青素的含量。但是香草醛法操作方式較多，不 利于使用者選擇，具體操作方法還需要進(jìn)行統(tǒng)一。國(guó)外 有學(xué)者利用HPLC／MS技術(shù)分析和檢測(cè)原花青素，過(guò)程 比較復(fù)雜，技術(shù)要求高，不能廣泛應(yīng)用于原花青素產(chǎn)品 的測(cè)定。

　　4 展望

　　葡萄籽原花青素?fù)碛懈咝У目顾ダ稀⒖剐难芗?病、抗癌功能，此外還具有抗輻射、抗疲勞，改善記憶力 等作用，顯示出了無(wú)比的優(yōu)越生物活性和安全性。目前 我國(guó)生產(chǎn)和銷(xiāo)售葡萄籽提取物就有50多家，年生產(chǎn)能 力超過(guò)80 t。因此，為了與葡萄籽提取物行業(yè)的蓬勃發(fā) 展相適應(yīng)，迫切需要建立起統(tǒng)一的葡萄籽及其產(chǎn)品中 原花青素含量的測(cè)定方法，以利于企業(yè)的生產(chǎn)貿(mào)易、產(chǎn) 品的質(zhì)量控制和顧客的消費(fèi)指導(dǎo)。